《细胞》:意义非凡!不修改DNA序列的表观遗传CRISPR来了,可逆、不脱靶,细胞分裂450代仍有效丨科学大发现

CRISPR/Cas9基因编辑技术大家都不陌生了:利用一段单链RNA片段 (常见的为single guide RNA,简称sgRNA)将核酸内切酶Cas9引导到目标位点,切断DNA双链,在此基础上即可实现对基因的剪切和编辑(www.tiaochuang.com.cn)。

尽管风头正盛,CRISPR/Cas9的局限性好像也不绝于耳,比如 脱靶效应、计划外的DNA片段丢失,以及激活的DNA修复机制可能引起细胞复杂的应激反应等等[1]。

既然基因编辑的目标是调控蛋白质的表达,那么,有没有可能绕过基因,从其他角度实现这个目标呢?

图源 | pixabay

当然可以了。

既然基因先需要转录成为信使RNA,再被翻译生成蛋白质,那么在不影响编码基因的双链DNA的情况下,通过人为控制基因的转录,同样可以达到调控蛋白质表达的效果

这种新兴的技术,叫做表观遗传编辑,即不直接修改基因序列,而是 通过DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化等方式,从转录层面调控目标基因表达

4月9日,一篇发表在《细胞》上的文章,报告了一项全新的基于CRISPR的表观遗传编辑技术[2]: CRISPRoff

研究者们利用sgRNA能够把Cas9引导到目标位点的能力,但避开了Cas9对的DNA剪切能力,而是 将失去酶活性的Cas9(dCas9)与DNA甲基转移酶Dnmt3A、3L以及锌指蛋白10的KRAB结构域相融合,从而达到目标位点DNA甲基化的效果,实现目标基因表达的降低。同时,研究者还开发了匹配的CRISPRon,能够对CRISPRoff的编辑进行逆转。

这项技术从表观遗传层面实现基因表达的抑制, 其效果不仅精准高效、适用基因广泛,更是经得住多达450代的细胞分裂、以及干细胞的分化,可以说是表观基因编辑技术的大进步!

CRISPRoff并不是世上第一个特异性表观遗传编辑技术。从原理上来讲,特异性的表观遗传编辑技术,都需要借助某些蛋白的DNA结合域 (如锌指蛋白,转录激活因子样效应物核酸酶(TALE),以及Cas9等),将它们与能够改写表观基因标记的酶结合在一起,产生目标位点的表观基因改写[3]。 这些技术的有效性,则既取决于DNA结合域的特异性,也取决于所结合的酶的功效。

然而,目前的表观遗传编辑技术编辑效果还很有限,想要得到稳定的效果, 需要在细胞内长期表达相关的功能性蛋白,如果需要针对多个基因,还需要引入多个功能性蛋白。这不仅使得该技术在实验室里用起来不便,更大大限制了它作为新型基因治疗手段的转化前景。

相比之下,CRISPRoff的表现非常优秀。

具体有多优秀呢?研究者们在对HEK293T细胞系 转染了一次表达融合蛋白的质粒和sgRNA后,检测到目标基因编码的蛋白表达明显下降,相应地,目标基因转录的信使RNA减少,其CpG岛的DNA甲基化增加。

重点来了: 50天后,细胞已经经过多代分裂,dCas9融合蛋白早在40天前就检测不到了,依然有超过90%的细胞保持了基因表达关闭的状态。这说明,仅仅一次dCas9融合蛋白的表达和sgRNA递送,就可以得到持久的表观基因编辑效果!

经过CRISPRoff处理后的细胞,50天后保持了基因表达沉默的状态(左),目标基因CGI甲基化显著增加(右,黑点代表检测到DNA甲基化)

CRISPRoff还具有优异的特异性以及适用广泛性。

全基因组亚硫酸盐测序结果显示, 在目标基因前后55kb的范围内,只有目标基因的CpG岛DNA甲基化水平出现显著增加,说明了 CRISPRoff并不会影响到目标位点邻近序列的表观基因状态

只有目标基因CLTA的CpG岛甲基化显著增加(蓝色为未甲基化)

为了探索CRISPRoff的适用广泛性,研究者们使用了一个针对超过20000个基因的sgRNA库,进行了一个drop-out screen。

简而言之,因为这些目标基因中有很多对细胞存活至关重要(essential genes),它们一旦被CRISPRoff沉默,就会导致细胞的死亡,相应的sgRNA也会随之消失。 通过检测存活下来的细胞中的sgRNA,就可以知道哪些基因被有效地沉默了

深度测序结果显示,在CRISPRoff处理过的细胞中, 绝大多数影响细胞存活的基因都被有效沉默了,说明了CRISPRoff的广泛实用性

在经CRISPRoff处理后存活下来的细胞中,检测到与essential genes有关的sgRNA广泛减少

这些都还不够, CRISPRoff的优秀之处还体现在,它的表观遗传改写效果,居然 在细胞分化后也可以保持

在干细胞分化的过程中,表观遗传需要经过大量变化,以大范围调控许多基因的表达状态。研究者们发现, 在诱导性多能干细胞中引入CRISPRoff,并诱导其分化为神经元细胞,分化后的细胞仍然保留了目标基因的表达水平降低效果

经过CRISPRoff处理的iPSC,经诱导分化为神经元细胞后,其基因沉默效果依然保持,与未经诱导的iPSC沉默水平相近

这么稳定且持久的表观基因改写效果,想反悔怎么办?没关系,该研究团队还针对性地开发了“后悔药”——CRISPRon技术,用于逆转CRISPRoff的编辑效果。

CRISPRon的原理与 CRISPRoff类似,同样是利用了sgRNA和dCas9组合的定位能力,只是在dCas9上融合了DNA去甲基酶。在细胞系中的测试结果显示, CRISPRoff处理过的细胞,经过一次 CRISPRon的处理后,有74%恢复了目标基因的表达,目标基因的CpG岛甲基化也基本消失

CRISPRon可以逆转CRISPRoff的表观基因编辑效果,包括基因表达的恢复(左)和DNA甲基化的恢复(右)

有趣的是,CRISPRoff的开发过程中还有“意外之喜”。

众所周知,DNA由A、T、C、G四种碱基编码而成,通常来说,只有与G相邻的C可以被甲基化。在人类基因组中,只有70%的基因具有CpG岛,也就是说, 按照已知的表观基因调控机制来说,有30%的基因是无法被通过DNA甲基化来调控的

但是,在对 CRISPRoff的表征中,研究者们发现, 一部分可以被 CRISPRRoff改写的基因,并没有传统意义上CpG岛 ,说明现有的表观遗传学理解还远不是全部。鉴于科学界对表观遗传的“求知若渴”,以及表观遗传在一些疾病中的重要作用, CRISPRRoff作为一项潜在的表观基因研究工具,也是意义非凡。

总的来说, CRISPRoff使用灵活,效果稳定、可逆,适用基因广泛,且编辑效果耐细胞分裂与分化,可以说令人耳目一新!无论是在基础研究中,用来研究细胞自有的表观遗传调控机制、或者通过调控表达来研究一些重要基因在细胞分化过程中的作用,还是在细胞治疗和基因治疗中的转化前景, CRISPRoff都算得上是未来可期。

参考文献:

本文作者 | 刘 一

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